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Nº 9 – Año 2020 IDITEC ISSN: 2525-1597

placas, una de las cuales contenía cicloheximida (CH), que evita el crecimiento de hongos y la otra
cicloheximida más ácido nalidixico (CH/NA) que inhibe el crecimiento tanto de hongos como de
bacterias Gram negativas.
Estas muestras fueron procesadas de manera que permitan aislar microorganismos predominantes en cada
uno de los sitios de muestreo como también para el estudio de las comunidades microbianas in situ
mediante microscopía de alta resolución.

Cultivos bacterianos
Las muestras fueron colectadas desde las superficies de interés mediante un hisopo estéril y sembradas en
placas de Petri estériles conteniendo medio LB pH 7.0. Cada muestreo se hizo por duplicado en placas
conteniendo CH y CH/NA. Las placas fueron incubadas en estufa de cultivo a 30 ºC hasta que se observó
crecimiento bacteriano. Una vez que obtenidas las colonias, cada fue repicada a una nueva placa con
medio fresco LB, sólido a pH 7.0. Las placas fueron mantenidas por repiques sucesivos. Posteriormente a
fin de preservar las cepas aisladas se conservaron en una solución de glicerol al 25 % a -20 ºC.

Microscopía Electrónica
Tanto para el estudio in-situ de microbiomas presentes en muestras recolectadas como de las cepas
aisladas se utilizaron métodos de Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) utilizando equipamiento y
protocolos puestos a punto en el Centro de Investigaciones y Servicios de Microscopía Electrónica
CISME UNT-CONICET (Albarracín et al., 2005; Albarracin et al., 2008; Albarracin et al., 2016; Bequer-
Urbano et al., 2013; Farias et al., 2013; Toneatti et al., 2017).
Para el estudio de las colonias en el cultivo, de las placas con medio LB sólido se tomaron pequeños
bloques de 5 mm de lado conteniendo las colonias de interés que fueron colocados en fijador Karnovsky.
Por otro lado, para el análisis de la morfología de las bacterias aisladas se llevó a cabo la siembra en
medio LB líquido (Triptona 1 %, NaCL 1 %, Extracto de levadura 0,5 %) a pH 7. Las muestras se dejaron
crecer en agitación constante (180 r.p.m a 30ºC) durante 24 h (Biosan, Orbital Shaker-Incubator ES-20).
A continuación, 10 mL de medio líquido de cada una de las cepas en estudio con una Densidad Óptica
(DO) de 0,6 lo cual corresponde a la fase de crecimiento exponencial, fueron centrifugados a 3500 r.p.m
durante 15 min. El pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril (NaCl 0,9 %) y centrifugado
nuevamente a 3500 r.p.m durante 15 minutos. Se repitió el último paso y finalmente el pellet fue
resuspendido en 1,5 mL de fijador Karnovsky. La fijación se realizó durante 24 h. Desde este punto, todas
las muestras (cintas de papel, colonias aisladas en agar, bacterias crecidas en medio líquido) siguieron el
mismo protocolo de procesamiento para su observación mediante MEB. Las muestras fueron
deshidratadas por pasaje de las muestras en una batería de alcoholes de graduación creciente (30°, 50°,
70°, 90°,100°) de 10 min cada uno empleando una placa de multipocillos. En el caso de los fragmentos de
agar y las muestras en medio líquido fueron colocados sobre cubreobejos redondos dispuestos dentro de
los pocillos de las placas. Los fragmentos de cintas fueron colocados directamente dentro de los pocillos.
Luego las muestras fueron retiradas y colocadas en gradillas de metal donde se realizaron dos pasajes
sucesivos de 10 min cada uno en acetona 100 %. A continuación, se realizó el punto crítico de secado en
equipo Denton Vacuum modelo DCP-1. El montaje de las muestras se efectuó sobre stubs de aluminio
(soporte) que en su superficie tienen una cinta adhesiva conductora doble faz de carbón. Posteriormente,
cada muestra fue recubierta con oro (coating) en un Ion Sputter Marca JEOL modelo JFC-1100. La
observación se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de barrido Marca Zeiss modelo SUPRA
55VP. Para la obtención de imágenes se empleó el modo de detección de electrones secundarios (SE2), a
un voltaje de 3 kV. La Figura 1 esquematiza el procesamiento de las muestras para su observación
mediante MEB.

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